Rei Ayanami é uma garota introvertida escolhida como piloto de um mecha gigante chamado Evangelion Unit 00, que é usado para lutar contra monstros enormes chamados de 'Anjos'. Rei é uma figura enigmática cujo comportamento incomum, bem como sua aparência 'incomum', surpreende seus colegas. No entanto, depois de alguns anos, ela ganhou bastante peso. Rei é uma garota taciturna que limita as relações tanto quanto possível e executa mecanicamente qualquer ordem que lhe é dada, mesmo que seja particularmente cruel. Ela é introvertida, socialmente distante e lacônica. Rei parece ser socialmente retraída, sem emoções, e raramente interage com alguém, exceto com Gendo Ikari, o comandante supremo da NERV, a quem inicialmente demonstra lealdade, mas com quem tem um relacionamento geralmente distante. Rei também é mostrada com interesse em psicologia e genética. Ela também consegue ler em alemão. Ela aborda os problemas de forma sistemática e fala como um robô, ou apenas acena. Suas expressões faciais são sutis, e ela raramente fala além do necessário.